Năm 1940, là bí thư Tỉnh ủy Bạc Liêu, được xứ ủy Nam Kỳ chỉ định vào Liên Tỉnh ủy Hậu Giang. Chính quyền Pháp biết Trần Văn Thời là một cán bộ lãnh đạo nên truy lùng, nhưng nhiều lần đều bất thành.
Năm 1940, khởi nghĩa Nam Kỳ bùng nổ, Trần Văn Thời phụ trách Ban chỉ huy quân sự tỉnh cùng Tỉnh ủy Bạc Liêu chỉ đạo khởi nghĩa ở đảo Hòn Khoai. Khởi nghĩa thất bại, Trần Văn Thời tập hợp lực lượng vào rừng U Minh để tránh khủng bố, xây dựng căn cứ, lập xưởng sản xuất vũ khí.
Năm 1941, được cấp trên điều về xây dựng lực lượng ở Châu Đốc (lấy tên là Nguyễn Văn Chất)
Tháng 5 năm 1941, Trần Văn Thời bị Chính quyền Pháp bắt và tra tấn nhưng ông quyết bảo vệ tổ chức của Đảng cộng sản, kể cả tên thật[cần dẫn nguồn]. Chính quyền Pháp đã kết án Trần Văn Thời 20 năm tù, đày ra Côn Đảo.
